Sistema de fotometria por fibra para pesquisa FLiP

para neurociênciade fibra ópticade fluorescência

Visão geral
O RWD Fluorescence Lifetime Photometry System (FLiP) combina Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) com fotometria por fibra para monitorar em tempo real mudanças na vida útil da fluorescência no cérebro de animais em livre movimentação. O FLiP permite medições in vivo estáveis e quantitativas da dinâmica de neurotransmissores, interações proteína–proteína e alterações conformacionais, reportando a vida útil da fluorescência (τ), um parâmetro intrínseco largamente independente do nível de expressão da sonda, fotobranqueamento e artefatos de movimento.

Por que a vida útil da fluorescência?

• A vida útil é independente da concentração do fluoróforo e da potência de excitação e reflete o microambiente local e alterações conformacionais.
• Fornece leituras quantitativas comparáveis entre amostras sem necessidade de normalização à linha de base.
• Adequado para gravações estáveis de longo prazo em estudos do sono, modelos de doenças crônicas e estudos longitudinais.
• Permite detecção sensível de mudanças dinâmicas de analitos usando biossensores baseados em vida útil.

Dois métodos de medição predominantes

• Domínio temporal (TCSPC): Excita a amostra com luz pulsada e registra a decadência temporal da fluorescência. O TCSPC marca temporalmente fótons individuais para construir histogramas de decadência e extrair vidas úteis por ajuste exponencial. Oferece alta resolução temporal e SNR superior sob baixo fluxo de fótons; resolve múltiplos componentes de vida útil com alta precisão.
• Domínio de frequência: Excita com luz contínua modulada sinusoidalmente e deriva a vida útil a partir do atraso de fase e da profundidade de modulação. Implementação mais simples e aquisição rápida, adequada para amostras com alto fluxo de fótons ou sistemas sem laser pulsado.

Comparação (Domínio temporal vs Domínio de frequência)

• Precisão da medição da vida útil — Domínio temporal (TCSPC): alta; Domínio de frequência: boa
• SNR para amostras fracamente fluorescentes — Domínio temporal (TCSPC): excelente; Domínio de frequência: relativamente limitado
• Resolução de múltiplos componentes de vida útil — Domínio temporal (TCSPC): alta precisão; Domínio de frequência: requer modulação multifrequência ou análise phasor
• Velocidade de aquisição — Domínio temporal (TCSPC): relativamente rápida; Domínio de frequência: rápida
• Amostras com alto fluxo de fótons — Domínio temporal (TCSPC): bom; Domínio de frequência: excelente
• Requisito de laser — Domínio temporal (TCSPC): laser pulsado; Domínio de frequência: fonte contínua modulada

Destaques do sistema FLiP

• Estabilidade do sistema concebida para minimizar flutuações do estado do dispositivo e permitir comparações longitudinais fiáveis.
• Ruído de sistema reduzido para preservar a integridade do sinal em níveis de fluorescência fracos.
• Capacidade para gravações de longo prazo com deriva de linha de base minimizada ao longo de semanas consecutivas.
• Compatibilidade com uma ampla gama de biossensores de vida útil de fluorescência.
• Análise quantitativa direta: funcionalidade de curva padrão planeada para converter leituras de vida útil em estimativas de concentração.

Exemplos de aplicação

• Medições de neuromoduladores entre animais e em escalas crônicas: leituras de vida útil (por ex., GRAB ACh3.0) permanecem estáveis apesar da variabilidade de potência do laser e de expressão, e podem distinguir estados comportamentais.
• Estudos mecanísticos de genes de risco psiquiátrico: FLiP utilizado para revelar dinâmicas anormais de PKA estriatal em camundongos mutantes Akap11 em gravações de animais livres.
• Desenvolvimento e validação de novos sensores de vida útil: por ex., LifeCamp sensor de vida útil de cálcio que permite a medição absoluta de sinais de cálcio transitórios e basais através de tipos celulares e comportamentos.

Características / especificações técnicas

• Especificações gerais do sistema
  • Opções de comprimento de onda de excitação: 488, 515, 560, 640, 670 nm (personalizável)
  • Frequência de pulso: 1–80 MHz
  • Faixa de medição da vida útil: 1–10 ns
  • Taxa de amostragem: 1–50 Hz
  • Contagem DIO: 8
  • Nível de tensão: 3.3–5 V
  • Diâmetro do núcleo da fibra óptica: 200 ou 400 µm
  • Abertura numérica (NA): 0.37
• Compatibilidade com biossensores de vida útil (exemplos com comprimentos de excitação)
  • Ca2+: Tq–Ca–FLITS — excitação ~439 nm; tr-CCaMP — ~437 nm; tr-GCaMP — ~493 nm; tr-RCaMP — ~563 nm; RCaMP1h — ~560 nm; LifeCaMP — ~488 nm
  • ACh (acetilcolina): GRAB ACh3.0 — 488 nm; variantes GRAB FLIM-ACh — 515 nm; GRAB WHalo-ACh-1.0 (baseado em corante) — 565 nm / 680 nm (dyes JF)
  • DA (dopamina): dLight3.8 — 488 nm; GRAB FLIM-DA1.0 — 515 nm
  • PKA: tAKARα, tAKARβ, tAKARγ — 488 nm; FLIM-AKAR — 488 nm; GRAB FLIM-PKA — 515 nm
  • PKC: CKAR3 — 488 nm
  • Glutamato extracelular: Rncp-iGluSnFR1 — 560 nm
  • Serotonina (5-HT): sDarken — 488 nm
  • Norepinefrina (NE): GRAB FLIM-NE1h / GRAB FLIM-NE1m — 515 nm; GRAB rNE3.0 — 560 nm; GRAB TMP-NE1.0 (baseado em corante) — ~690 nm; GRAB WHalo-NE — 565 nm / 680 nm (dyes JF)
  • 5-HT (variante): GRAB FLIM-5-HT0.3 — 515 nm
  • CRF: GRAB rCRF1.0 — 570 nm
  • PACAP: GRAB rPACAP1.0 — 570 nm
  • Glicose: iGlucoSnFR-TS — 400 nm
  • Lactato: LiLac — 425 nm
  • ATP: qMaLioffG — 488 nm