研究用ファイバーフォトメトリーシステム FLiP

神経科学光ファイバー蛍光

概要
RWD Fluorescence Lifetime Photometry System（FLiP）は、Time-Correlated Single Photon Counting（TCSPC）とファイバーフォトメトリーを組み合わせ、自由行動動物の脳内における蛍光寿命変化をリアルタイムでモニターします。FLiPは、蛍光寿命（τ）というプローブ発現量、フォトブリーチ、運動アーティファクトに左右されにくい内在的パラメータを報告することで、神経伝達物質の動態、タンパク質間相互作用、立体構造変化の定量的なin vivo測定を可能にします。

なぜ蛍光寿命か

• 寿命は蛍光体濃度や励起強度に依存せず、局所マイクロ環境やコンフォメーション変化を反映します。
• ベースライン正規化を要さない、サンプル間で比較可能な定量的出力を提供します。
• 睡眠研究、慢性疾患モデル、縦断研究などの長期安定記録に適しています。
• 寿命ベースのバイオセンサーを用いた動的なアナライト変化の高感度検出が可能です。

主な測定方式（2種類）

• 時間領域（TCSPC）：パルス光で試料を励起し、蛍光の時間的減衰を記録します。TCSPCは個々の光子をタイムスタンプし、減衰ヒストグラムを構築して指数関数フィッティングで寿命を抽出します。低光子フラックス下での高時間分解能と優れたSNRを提供し、複数の寿命成分を高精度で分解できます。
• 周波数領域：正弦波変調された連続光で励起し、位相遅延と変調深度から寿命を導出します。実装が簡便で取得が速く、高光子フラックスの試料やパルスレーザーを用いないシステムに適しています。

比較（時間領域 vs 周波数領域）

• 寿命測定精度 — 時間領域（TCSPC）：高い；周波数領域：良好
• 弱蛍光試料のSNR — 時間領域（TCSPC）：優秀；周波数領域：比較的制限あり
• 複数寿命成分の分解能 — 時間領域（TCSPC）：高精度；周波数領域：多周波数変調やファイザ解析が必要
• 取得速度 — 時間領域（TCSPC）：比較的速い；周波数領域：速い
• 高光子フラックス試料 — 時間領域（TCSPC）：良好；周波数領域：非常に良好
• レーザー要件 — 時間領域（TCSPC）：パルスレーザー；周波数領域：変調された連続光源

FLiPシステムの特徴

• 機器状態の変動を最小化するよう設計されたシステム安定性により、信頼性の高い縦断比較が可能です。
• 低ノイズ設計により、微弱信号でのデータ品質を維持します。
• 数週間にわたる連続記録におけるベースラインドリフトを抑えた長期記録が可能です。
• 主要な蛍光寿命バイオセンサーとの広い互換性。
• 定量解析機能：寿命出力を濃度推定に変換する標準曲線機能を予定。

応用例

• 動物間および慢性スケールでの神経変調物質測定：寿命出力（例：GRAB ACh3.0）はレーザー強度や発現変動に対して安定し、行動状態を識別できます。
• 精神疾患リスク遺伝子の機構研究：FLiPは自由行動記録においてAkap11変異マウスの線条体PKAダイナミクスの異常を明らかにしました。
• 新規寿命センサーの開発・検証：例）LifeCamp カルシウム寿命センサーは、細胞種や行動に跨る一過性および基底のカルシウム信号を絶対値で測定可能にします。

仕様 / 技術データ

• 一般システム仕様
  • 励起波長オプション：488、515、560、640、670 nm（カスタマイズ可）
  • パルス周波数：1–80 MHz
  • 寿命測定レンジ：1–10 ns
  • サンプリングレート：1–50 Hz
  • DIO数：8
  • 電圧レベル：3.3–5 V
  • 光ファイバーコア径：200 または 400 µm
  • 数値開口 (NA)：0.37
• 寿命バイオセンサー互換性（励起波長の例）
  • Ca2+: Tq–Ca–FLITS — 励起 ~439 nm; tr-CCaMP — ~437 nm; tr-GCaMP — ~493 nm; tr-RCaMP — ~563 nm; RCaMP1h — ~560 nm; LifeCaMP — ~488 nm
  • ACh（アセチルコリン）：GRAB ACh3.0 — 488 nm; GRAB FLIM-ACh バリアント — 515 nm; GRAB WHalo-ACh-1.0（色素ベース） — 565 nm / 680 nm（JF dyes）
  • DA（ドーパミン）：dLight3.8 — 488 nm; GRAB FLIM-DA1.0 — 515 nm
  • PKA: tAKARα, tAKARβ, tAKARγ — 488 nm; FLIM-AKAR — 488 nm; GRAB FLIM-PKA — 515 nm
  • PKC: CKAR3 — 488 nm
  • 細胞外グルタミン酸: Rncp-iGluSnFR1 — 560 nm
  • セロトニン（5-HT）：sDarken — 488 nm
  • ノルアドレナリン（NE）：GRAB FLIM-NE1h / GRAB FLIM-NE1m — 515 nm; GRAB rNE3.0 — 560 nm; GRAB TMP-NE1.0（色素ベース） — ~690 nm; GRAB WHalo-NE — 565 nm / 680 nm（JF dyes）
  • 5-HT（代替）：GRAB FLIM-5-HT0.3 — 515 nm
  • CRF: GRAB rCRF1.0 — 570 nm
  • PACAP: GRAB rPACAP1.0 — 570 nm
  • グルコース: iGlucoSnFR-TS — 400 nm
  • ラクト酸: LiLac — 425 nm
  • ATP: qMaLioffG — 488 nm