Kit de teste para pesquisa CFTK-HMM-0076

para pesquisa médicade coagulaçãoTMB

Nome do produto
Kit ELISA para fator de coagulação VIIa ativado humano (FVIIa) (Cat. No.: CFTK-HMM-0076)

Aplicação
Análise quantitativa in vitro do fator de coagulação VIIa ativado humano (FVIIa) em soro, plasma, homogeneizados de tecido, sobrenadantes de cultura celular e fluidos biológicos relacionados.

Princípio de detecção
O kit baseia-se num ensaio ELISA sanduíche de um passo com anticorpo duplo. Amostras, padrões e anticorpo de detecção marcado com HRP são adicionados a poços pré‑revestidos com anticorpo capturador anti‑FVIIa, incubados e lavados. O desenvolvimento da cor utiliza TMB catalisado por HRP (azul) e é interrompido por ácido (amarelo). A intensidade da cor é proporcional à concentração de FVIIa e é medida a 450 nm para cálculo da concentração.

Processamento de amostras

• Soro: Coletar sangue em tubos separadores, deixar coagular 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C, centrifugar a 1000×g por 20 min e recolher o sobrenadante; armazenar a -20°C ou -80°C se necessário. Evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento.
• Plasma: Coletar com EDTA ou heparina, centrifugar a 1000×g por 15 min a 2–8°C dentro de 30 min após a coleta, recolher o sobrenadante; armazenar a -20°C ou -80°C. Evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento.
• Homogeneizado de tecido: Lavar o tecido com PBS frio (0,01 M, pH 7,4), pesar e picar, adicionar PBS (tipicamente 1:9 p/p), adicionar inibidores de protease se necessário, homogeneizar no gelo, sonicar ou executar ciclos congelamento/descongelamento se necessário, centrifugar a 5000×g por 5–10 min e recolher o sobrenadante.
• Sobrenadante de cultura celular/outros: Centrifugar a 1000×g por 20 min e usar o sobrenadante para ensaio ou armazenar a -20°C/-80°C. Evitar amostras hemolisadas.

Reagentes / instrumentos / consumíveis necessários

• Leitor de microplacas (450 nm)
• Micropipetas de alta precisão e pontas: 0,5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1000 µL
• Incubadora a 37°C ou termostato
• Água destilada ou deionizada

Concentrações padrão

• 16 ng/mL
• 8 ng/mL
• 4 ng/mL
• 2 ng/mL
• 1 ng/mL
• 0,5 ng/mL

Preparação dos reagentes
Deixar os reagentes do kit equilibrarem à temperatura ambiente antes do uso. Preparar o Tampão de Lavagem 20× diluindo 1:20 com água destilada (1 parte de tampão 20× + 19 partes de água).

Procedimentos (resumo)

• 1. Equilibrar a placa à temperatura ambiente por 20 min; usar os poços necessários e selar os restantes para armazenamento a 4°C.
• 2. Adicionar 50 µL dos padrões nos poços de padrão.
• 3. Adicionar 50 µL da amostra nos poços de amostra (não adicionar nos poços em branco).
• 4. Adicionar 100 µL do anticorpo de detecção marcado com HRP em cada poço de padrão e amostra (exceto em branco), selar e incubar 60 min a 37°C.
• 5. Descartar o líquido e lavar cada poço com 350 µL da solução de lavagem, deixar 1 min; repetir a lavagem 5 vezes (ou utilizar lavadora de placas).
• 6. Adicionar 50 µL do substrato A e 50 µL do substrato B em cada poço, incubar 15 min a 37°C.
• 7. Adicionar 50 µL da solução de paragem em cada poço e medir a OD a 450 nm dentro de 15 min.

Cálculo dos resultados
Traçar a OD dos padrões em função da concentração para construir a curva padrão, obter a equação de regressão e calcular a concentração das amostras substituindo a OD da amostra na equação.

Desempenho

• Faixa de detecção: 0,5–16 ng/mL
• Sensibilidade: < 0,1 ng/mL
• Especificidade: Sem reatividade cruzada com análogos solúveis relacionados
• Repetibilidade: CV intra‑ensaio < 10 %; CV inter‑ensaio < 15 %

Notas / Considerações importantes

• 1. Diluir amostras que excedam a concentração máxima do padrão antes do ensaio.
• 2. Seguir rigorosamente os tempos e temperaturas de incubação; levar os reagentes a 20–25°C antes do uso e refrigerar após o uso.
• 3. Lavagem insuficiente ou secagem dos poços pode levar a resultados imprecisos; garantir lavagem adequada e evitar secagem durante as incubções.
• 4. Eliminar resíduos líquidos e impressões digitais no fundo da placa para evitar interferência na OD.
• 5. A solução de substrato deve ser incolor ou muito pálida; não usar se estiver azul.
• 6. Evitar contaminação cruzada de reagentes e amostras.
• 7. Proteger reagentes e reações da exposição a luz intensa durante armazenamento e incubação.
• 8. Equilibrar sacos selados à temperatura ambiente antes de abrir para evitar condensação.
• 9. Evitar contacto dos reagentes de reação com agentes branqueadores ou vapores de solventes fortes.
• 10. Não usar produtos expirados.
• 11. Manusear amostras potencialmente infecciosas de acordo com os procedimentos de biossegurança aplicáveis.

Especificações técnicas

• Cat. No.: CFTK-HMM-0076
• Espécie de teste: Humano
• Validade: 6 meses
• Armazenamento: 2–8°C
• Princípio de detecção: ELISA sanduíche de um passo com dupla anticorpo; detecção HRP/TMB; leitura OD a 450 nm
• Pontos da curva padrão: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 ng/mL
• Faixa de detecção: 0,5–16 ng/mL
• Sensibilidade: < 0,1 ng/mL
• CV intra‑ensaio: < 10 %; CV inter‑ensaio: < 15 %