研究用検査キット CFTK-HMM-0076

医療研究用凝固TMB

製品名
ヒト活性化凝固因子VIIa（FVIIa）ELISAキット（カタログ番号：CFTK-HMM-0076）

適用
血清、血漿、組織ホモジネート、細胞培養上清および関連する生体試料中のヒト活性化凝固因子VIIa（FVIIa）のin vitro定量検出に使用します。

検出原理
本キットはダブル抗体一段階サンドイッチELISA法に基づいています。捕捉抗体で前処理されたマイクロタイタープレートに検体、スタンダード、HRP標識検出抗体を順次添加し、インキュベートおよび洗浄します。基質TMBはHRPにより青色に転化し、酸で黄色に停止します。発色の濃さは試料中のFVIIa濃度に比例し、450 nmで吸光度を測定して濃度を算出します。

試料処理

• 血清：血清分離管で採取した全血は常温で2時間または4°Cで一晩放置して凝固させ、1000×gで20分遠心し上清を回収する。必要に応じて-20°Cまたは-80°Cで保存する。凍結融解の繰り返しは避けてください。
• 血漿：抗凝固剤としてEDTAまたはヘパリンを用いて採取し、採取後30分以内に2–8°Cで1000×g、15分遠心して上清を回収する。必要に応じて-20°Cまたは-80°Cで保存する。凍結融解の繰り返しを避けてください。
• 組織ホモジネート：冷却したPBS（0.01 M、pH 7.4）で残血を洗浄し、秤量して切断する。切断した組織をPBS（通常1:9 w/v）で懸濁し、必要に応じてプロテアーゼ阻害剤を添加して氷上でホモジナイズする。必要に応じて超音波処理または凍結融解を行い、5000×gで5–10分遠心して上清を採取する。
• 細胞培養上清その他：上清を1000×gで20分遠心し、上清を用いるか-20°C/-80°Cで保存する。溶血サンプルは適しません。

必要な試薬 / 機器 / 消耗品

• マイクロプレートリーダー（450 nm）
• 高精度ピペットおよびチップ：0.5–10 µL、2–20 µL、20–200 µL、200–1000 µL
• 37°Cインキュベーターまたは恒温器
• 蒸留水または脱イオン水

スタンダード濃度

• 16 ng/mL
• 8 ng/mL
• 4 ng/mL
• 2 ng/mL
• 1 ng/mL
• 0.5 ng/mL

試薬の調製
冷蔵状態から取り出した場合は使用前に試薬を室温に戻してから使用してください。20×洗浄バッファーの希釈：蒸留水で1:20に希釈（20×洗浄バッファー1に対し蒸留水19）。

操作手順（要約）

• 1. プレートを室温で20分平衡化し、必要なウエルを使用し、残りは再封して4°Cで保管する。
• 2. 異なる濃度のスタンダードを標準ウエルに50 µL添加する。
• 3. 試料を試料ウエルに50 µL添加する（ブランクウエルには添加しない）。
• 4. 各標準および試料ウエル（ブランクを除く）に100 µLのHRP標識検出抗体を添加し、封をして37°Cで60分インキュベートする。
• 5. 液を捨て、各ウエルを350 µLの洗浄液で洗浄し、1分放置する。これを5回繰り返す（またはプレートウォッシャーを使用）。
• 6. 各ウエルに基質A、Bをそれぞれ50 µL添加し、37°Cで15分インキュベートする。
• 7. 各ウエルに50 µLの停止液を添加し、15分以内に450 nmでODを測定する。

結果の計算
スタンダードのOD値（横軸）と濃度（縦軸）から標準曲線を作成し、回帰式を求め、試料ODを代入して試料濃度を算出する。

性能

• 検出範囲：0.5–16 ng/mL
• 感度：< 0.1 ng/mL
• 特異性：関連する可溶性アナログとの交差反応なし
• 再現性：同一プレート内CV < 10％；プレート間CV < 15％

注意事項 / 重要な考慮点

• 1. 最大スタンダード濃度を超える試料は、測定前に適切に希釈すること。
• 2. 指定されたインキュベーション時間および温度を厳守すること。使用前に全ての試薬を20–25°Cに戻し、使用後は冷蔵保管すること。
• 3. 洗浄不備やウエルの乾燥は誤差の原因となるため、適切な排液と乾燥回避を行うこと。
• 4. プレート底の液体残渣や指紋を除去してOD干渉を避けること。
• 5. 基質溶液は無色または非常に淡色でなければならない。青色に変色している場合は使用しないでください。
• 6. 試薬および試料の交差汚染を避けること。
• 7. 保管およびインキュベート時に強光に直接さらさないこと。
• 8. 密封袋は開封前に室温に戻して結露を防ぐこと。
• 9. 反応試薬を漂白剤や強い溶媒蒸気と接触させないこと。
• 10. 有効期限切れの製品は使用しないこと。
• 11. 感染性の疑いがある試料は、定められたバイオセーフティ手順に従って取り扱うこと。

技術仕様

• カタログ番号：CFTK-HMM-0076
• 検査対象種：ヒト
• 保存期間：6か月
• 保管温度：2–8°C
• 検出原理：ダブル抗体一段階サンドイッチELISA；HRP/TMB検出；450 nmでOD測定
• 標準曲線点：16、8、4、2、1、0.5 ng/mL
• 検出範囲：0.5–16 ng/mL
• 感度：< 0.1 ng/mL
• 同一アッセイ内CV：< 10％；アッセイ間CV：< 15％