O Fe(II) de todas as formas de hemoglobina, com exceção da sulfohemoglobina, é oxidado pelo ferrocianeto em Fe(III) para formar meta-hemoglobina, que por sua vez reage com cianeto ionizado (CN-) para formar cianometahemoglobina, um derivado muito estável que absorve a 540 nm. A intensidade da cor formada é proporcional à concentração de hemoglobina total na amostra.
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